lunes, 9 de julio de 2007

Practica # 1

Extracción de ARN total por método TRIZOL a partir de sangre


  • Antecedentes

(Chomczynski y Nicoletta Sacchi, 1987)

El método de extracción por Guanidin-tiocianato-phenol-cloroformo también conocido como método TRIZOL es un método común para aislar DNA, RNA y proteínas. Se basa en la separación de fases posterior a la centrifugación de una mezcla de fenol saturado con agua, cloroformo y un agente caotrópico desnaturalizante (guanidin-tiocianato) en una fase acuosa y una orgánica (fenol).

Lisis de eritrocitos: La sangre presenta una fase sólida, que comprende eritrocitos, linfocitos y plaquetas; así como también una fase líquida, representada por el plasma sanguíneo. Los eritrocitos pueden separarse del resto de la sangre mediante un buffer de lisis (NH4Cl, KHCO3, EDTA) para obtener ARN a partir de células blancas y hacer un análisis de poliformismos. El EDTA es un agente quelante que evita que la sangre se coagule, al centrifugarse precipita el Calcio contenido en la sangre, dejando el plasma como sobrenadante, este es desechado y los eritrocitos (pellet) son tratados con un buffer salino (PBS).

Separación de fases: Puede realizarse sobre sangre fresca, como se hizo en la practica, o bien sobre células blancas, obtenidas mediante lisis de eritrocitos. La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El trizol (guanidin tiocianato-fenol-clorformo) desnaturaliza proteínas haciéndolas insolubles en la preparación. La centrifugación ayuda a determinar las fases, permitiendo la separación de las sustancias mediante un gradiente de sedimentación. El pH es un factor fundamental en la separación de fases por lo que es importante que el fenol que se usa (para preparar el Trizol) provenga de una disolución acuosa y no de un buffer.

La mayor parte de ARN se extrae de la fase acuosa, pues permanece soluble en la fase superior de ácidos acuosos, mientras que el DNA puede encontrarse en la interfase o en la fase orgánica (inferior) junto con las proteínas. Se debe tener extremo cuidado en el manejo del ARN para evitar su degradación usando materiales y sustancias libres de RNAsas. El volumen de la fase acuosa es aproximadamente igual a l volumen de Trizol utilizado.

El ARN obtenido es tratado con Isopropanol y Etanol, en ciclos repetidos de centrifugación para deshacerse de las proteínas que se encuentran en la solución. Se desecha el sobrenadante que contiene las proteínas, y se deja abierto el epppendorf, que contiene el pellet, para evaporar solamente el sobrenadante, que volátil a temperatura ambiente, la pastilla de ARN no debe secarse por completo porque se haría insoluble, el ARN se solubiliza en agua libre de RNAsas.

Cuantificacion de ARN

Para verificar que el ARN que se obtuvo no se encuentra contaminado con proteínas, se mide el espectro de absorción de la muestra en el espectrofotómetro a 260nm para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos presentes y 280nm para proteínas.

Para la cuantificación se toma como referencia (cero), el agua DEPC, en la que esta diluida el RNA. Se toma la absorción a 260 y 280 nm.

Finalmente se realiza un gel de azarosa para identificar las bandas que han sido amplificadas (28S y 18S).

La muestra puede usarse si la proporción (A260/A280) >1.7 .

Cálculo de concentración:

Absorbancia a 260 x 40 x factor de dilución (100) = μg/ml ó ng/μl


Electroforesis:

Para verificar que los ácidos nucleicos que se cuantificaron son de ARN y no DNA contaminante, se migra la muestra por electroforesis.


La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según su tamaño y carga eléctrica, para la que se usa un gel de agarosa al que se le aplica un campo eléctrico haciendo que se desplacen las moléculas a través del los poros del gel. Así, las moléculas pequeñas avanzan más y las grandes quedan más cerca de los pozos de partida.

En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato.

Gel de agarosa:

Se prepara con el buffer TAE, que contiene tris base, acido acético y EDTA(agente quelante), así se evita cambios bruscos en el pH y plegamiento de las muestras; también se añade Bromuro de etilio para poder ver las bandas obtenidas en la electroforesis tanto las de las muestras teñidas con buffer de carga como las correspondientes al marcador de peso molecular, al exponerse a luz uv.


Para facilitar la determinación del peso molecular se corre un marcador de peso molecular, formado por unos 10 diferentes transcritos de cuyos tamaños van desde los 500 a 9000 pares de bases. Al correr el gel se forman las bandas de la escalera que sirven como referencia para medir la longitud (pares de bases) de las bandas que se forman al correr la muestra, y así comprobar que correspondan a las subunidades 28S(4.8kb) y 18S (1.8kb) del ARN. De encontrarse ADN contaminante en la muestra aparece una banda mucho mas arriba de la que correspondiente a 28S.


  • Objetivo

Familiarizarse con el método TRIZOL para obtener ARN, a partir de sangre.


  • Materiales:

  1. TRIZOL (Invitrogen) solución monofástica de Guanidin tiocianato – fenol – cloroformo

  2. Cloroformo

  3. Isopropanol

  4. 75% Etanol

  5. Agua – DEPC

  6. Buffer de lisis 10 X: 89.9 g NH4Cl, 10.0 g KHCO3, 2.0 ml 0.5 M EDTA. Disolver los productos precedentes en 800 ml de ddH2O y ajustar el pH a 7.3. completar a 1 litro y mezclar completamente.

Propiedades y toxicidad de los materiales:

Cloroformo(CHCl3): A temperatura ambiente, es un líquido volátil altamente inflamable, transparente, de olor característico a cítricos y sabor dulce. Se utiliza como disolvente de compuestos orgánicos

Toxicidad: Respirar cerca de 900 ppm de cloroformo, puede causar insomnio, delirios, mareo, cansancio, cefalea, migraña y leves alucinaciones; más de 990 ppm puede producir la muerte por paro cardiorespiratorio. A largo plazo puede dañar el hígado y riñones, vías respiratorias causando necrosis de los tejidos expuestos. El contacto de la piel puede producir ulceración.


Bromuro de Etidio (BET): Agente intercalante, mutagénico.

- bajo UV fluoresce

- para su manejo debe usarse doble guante de látex o guante de nitrilo

- Manejar como deshecho tóxico


Fenol en forma pura es un sólido cristalino de color blanco-incoloro a temperatura ambiente. Punto de ebullición de 182ºC. El producto comercial es un líquido. Tiene un olor repugnantemente dulce y alquitranado.

Se puede detectar el sabor y el olor del fenol a niveles más bajos que los asociados con efectos nocivos. Se inflama fácilmente, es corrosivo y sus gases son explosivos en contacto con la llama.



Alcohol isopropílico

Estado de agregación

Líquido

Apariencia

Incoloro


Punto de inflamabilidad

(12 °C)




ETANOL


Líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78 °C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla azeotrópica con un contenido de aproximadamente el 96 % de etanol. Su mayor potencial bactericida se obtiene a una concentración de aproximadamente el 70 %.


Agua DEPC

Dietilpirocarbonato

Se hidroliza en Etanol y CO2

Una solución 0.1% DEPC inactiva RNAsas

Libre de endodeoxiribonucleasas, exodeoxiribonucleasas, ribonucleasas y fosfatasas.

Es una agua desionizada

Se recomienda usar en reacciones donde se utiliza RNA.


  • Protocolo

Los pasos 1 -10 son útiles para extracción de ARN a partir de células blancas.


Lisis de Eritrocitos:


  1. Transferir 2 ml de sangre a un tubo de 50 ml

  2. Llenar hasta la marca de 50 ml con buffer de lisis, mezclar lentamente por inmersión.

  3. Dejar a temperatura ambiente por 15 minutos

  4. Centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos a 4ºC

  5. Vaciar cuidadosamente el sobrenadante

  6. Resuspender el pellet celular en 1 ml de buffer de lisis y transferir a un tubo de 1.5 ml, dejar reposar 4 min. a TA

  7. Centrifugar por 2 min. a 4ºC a 2000 rpm y aspirar el sobrenadante

  8. Resuspender Pellet en 1 ml de PBS 1X y centrifugar como en paso 7

  9. Retirar el sobrenadante y resuspender pellet en 100 µl de PBS.


Separacion de fases:


  1. Añadir 1 ml de TRIZOL, mezclar por 20 s (vórtex), esperar 5 min. a T. A
    *Este paso puede ser usado sobre 100 µl de sangre fresca
    *Posterior a este paso las muestras pueden ser congeladas a -70ºC

  2. Añadir 200 µl de cloroformo, agitar a mano fuertemente por 15 s, esperar 5 min. a T. a

  3. Centrifugar 15 min. a 12000 x g y a 4ºC

  4. Transferir la fase acuosa, sin tocar la interfase, un tubo RNAsa libre de 1.5 ml.


Precipitación de ARN


  1. Añadir 500 µl de isopropanol, esperar 10 min. TA

  2. Centrifugar 10 min. a 12000 x g y a 4ºC

  3. vaciar isopropanol y agregar 1 ml de etanol 75 %

  4. Centrifugar 10 min. a 8000 x g a 4ºC

  5. Vaciar etanol del tubo invirtiéndolo y sin regresarlo a la posición original dejarlo reposar 5 min. sobre un papel, retornar el tubo a la posición normal y dejar secar la pastilla por 15 minutos. Es importante no dejar secar la pastilla completamente ya que eso dificulta la resolubilización del ARN.

  6. Resuspender ARN en 25 µl de H2O-DEPC


Cuantificación y calidad del ARN


  1. Cuantificar el ARN haciendo una dilución 1:100 en H2O-DEPC, midiendo a 260 nm y 280 nm en el espectrofotómetro.

  2. Migrar 4µl del RNA en un gel de azarosa 1.5 % Bromuro de Etidio, identificar bandas 28s y 18S, verificar ratio 2:1 y ausencia de ADN contaminante. Tomar foto.


Puntos importantes en le manejo del ARN

- Usar guantes en todo momento

- Área de trabajo limpia

- Sólo usar pipetas exclusivas para ARN

- Usar conos exclusivos libres de RNAasa y con filtro

- Usar material libre de RNAsas

- Hornear material de vidrio a 150oC por 4 horas y plásticos pueden ser bañados en una solución 0.5 M de NaOH, enjuagados con agua- DEPC y pasados al autoclave.


Manejo de Sangre

- Depositar deshechos en una solución 10% de cloro

- Manejar toda muestra como potencialmente infecciosa

- La sangre contiene muchas RNAsas

- Utilizar sangre fresca (no más de 24 horas extracorporal)


Realización de un gel de TAE-agarosa

TAE 1.5% - BET

  • 49 ml agua milliQ + 1 ml de TAE 50X , ponerlos en un matraz de

  • 250 ml.

  • Añadir 0.5 gramos de Agarosa

  • Calentar en microondas hasta que la Agarosa se haya derretido,

  • con la tapa ligeramente abierta a fin de permitir que salga la presión

  • Enfriar el matraz sobre chorro de agua hasta que la temperatura

  • sea soportable sobre la mano

  • adicionar 1 μl de solución de BET (Bromuro de etidio 10mg/ml)

  • Vaciar la agarosa sobre el molde con los peines

  • Esperar a solidificación a TA o 10 minutos a -20oC.

  • Colocar el gel en la cámara de electroforesis y agregar buffer TAE

  • 1X hasta que se encuentre cubierto.

  • Pasar corriente 80-100 V por 10 minutos

  • Cargar muestras y migrar a 80 V

Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, vertir con cuidado la mezcla en la bandeja.

  • Dejar que se torne opaco y sólido.


  • Problemas y como los resolviste


  • Resultados finales


  • Puntos cruciales que usted considere para que el protocolo funcione

-después de añadir el Trizol la solución debe resuspenderse con una punta de pipeta estéril para fragmentar el ADN minimizando su prescencia en la fase acuosa.

-unas vez que se ha realizado la separación de fases con trizol, la extracción de ARN debe empezarse desde la superficie de la fase acuosa, porque si empieza a pipetearse dentro de la fase acuosa es muy posible que se extraiga el ADN que se encuentra en la interfase pues presenta el mismo aspecto que la fase acuosa.

-cuando se agitan o mezclan las soluciones hay que asegurarse de que los recipientes están bien cerrados.